Patologia Molecular

Hibridização in situ (HIS)

O princípio da HIS é a geração de pequenas sequências de oligonucleotídeos, chamadas sondas, de DNA marcadas com um substrato. Essas sondas são complementares às sequências genômicas de interesse, e posteriormente são hibridizadas (ligação complementar entre as sequências) diretamente no corte histológico de tecido na lâmina de vidro. Com a HIS, existe o benefício da avaliação simultânea da morfologia celular da neoplasia e a alteração no genoma de interesse na mesma amostra. Estas técnicas são mais complexas e trabalhosas que a imuno-histoquímica, necessitando de mais tempo para sua realização.

Assim como na IHQ, porém em menor escala, variáveis pré-analíticas, como a deficiente preparação da amostra (fixação inadequada), podem levar a perda de sinais, artefatos de coloração e alteração de morfologia, dificultando sua interpretação. A HIS pode ser aplicada a vários tipos de amostras: células em cultura, tecido incluído em parafina, tecido congelado, fluidos, aspirados citológicos e microarranjos de tecido. A realização de HIS de forma manual ou automatizada apresenta resultados comparáveis e semelhantes, sendo ambos os métodos confiáveis.

De forma resumida, a técnica envolve o pré-tratamento da amostra, posterior digestão proteica, desnaturação, adição de sonda de oligonucleotídeos marcada, e subsequente hibridização. A imunodetecção da sonda segue após lavagem e envolve a aplicação de anticorpos marcados. Por fim, o resultado é visualizado em microscópio de luz ou de fluorescência.

FISH (fluorescence in situ hybridization)

A técnica de FISH (hibridização in situ por fluorescência) para investigação de mutações genômicas está bem estabelecida e apresenta evidência clínica de relação diagnóstica, prognóstica e preditiva comprovada em várias neoplasias. A sonda de FISH é marcada com revelador fluorescente que pode ser visualizado com microscópio de fluorescência. Uma alta especificidade e boa reprodutibilidade da técnica foi demonstrada desde o seu desenvolvimento. Por exemplo, FISH é considerado por muitos autores o método padrão-ouro para avaliação da amplificação do gene HER2 e foi utilizado nos primeiros ensaios clínicos que avaliaram o desfecho de pacientes com carcinomas HER2 positivos.

Os sinais fluorescentes diminuem com o tempo e não podem ser arquivados. Nessa técnica, a observação detalhada da morfologia tumoral é apenas parcial, o que torna necessária a correlação com corte histológico corado com HE para garantir avaliação adequada do componente investigado do componente normal da amostra, e possibilitar a identificação de heterogeneidade intratumoral.

CISH (chromogenic in situ hybridization)

A técnica de CISH (hibridização in situ cromogênica) é um método de hibridização in situ, semelhante ao FISH, que usa sondas de DNA marcadas com cromógeno para serem observadas em microscópio de luz. As principais vantagens da técnica de CISH são a possibilidade de interpretação com o microscópio de luz, preservação detalhada da morfologia, sinais permanentes com possibilidade para arquivamento, menor complexidade técnica e menor tempo de reação. Uma alta concordância (superior a 95%) entre FISH e CISH foi demonstrada na maioria dos estudos que comparam as duas técnicas.

SISH

A técnica de SISH baseia-se na deposição de prata no alvo hibridizado após uma reação enzimática metalográfica (Ventana, 2012). Os sinais são permanentes e podem ser observados com microscópio de luz. Essa técnica pode ser totalmente automatizada e tem um tempo de reação abaixo de 6 horas (Ventana, 2012). Os índices de concordância do SISH com FISH variam entre 87% e 97%. A agência reguladora americana FDA (Food And Drug Adminstration) recentemente aprovou algumas técnicas de dupla marcação com sondas para HER2 e CEP17 que usam SISH e CISH para interpretação.

Lista de Sondas

• 1p/19q
• ALK
• CCND1/IGH
• DDIT3 (12q13.3, CHOP)
• EBER (RNA)
• EGFR
• ETV6
• EWSR1 (22q12)
• FOXO1 (13q14.11, FKHR)
• FUS (16p11, TLS)
• ERBB2 (HER2)
• HPV Alto Risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45)
• HPV Baixo Risco (6, 11, 40, 42)
• Imunoglobulina Kappa
• Imunoglobulina Lambda
• MDM2 (12q15)
• MYC (8q24)
• ROS1
• SS18 (18q11.2, SYT)

Genotipagem

As técnicas de citogenética molecular que fazem uso de extração de moléculas de DNA ou RNA em células e tecidos para realização de reação em cadeia da polimerase (PCR) e eletroforese em matriz sólida (Southern Blot e Western Blot) são altamente sensíveis e específicas. O PCR é uma técnica de alta sensibilidade, com técnica de complexidade moderada. Porém, têm como limitação, a possibilidade de apresentar contaminantes de diluição após o rompimento das células durante a homogeneização. O tecido amostrado de uma neoplasia, por exemplo, além das células cancerígenas, contém células normais, células dos vasos sanguíneos e células inflamatórias, que podem contaminar a reação levando a um resultado falso-negativo. Adicionalmente, na técnica não há possibilidade de avaliação simultânea da morfologia tecidual. Com isso, as condições pré-analíticas para este tipo de ensaio devem ser cuidadosamente avaliadas para que a extração do ácido nucleico seja adequada. A fixação em formalina tamponada é essencial e a percentagem de tecido neoplásico na amostra deve ser indicada. Quando necessário uma microdissecção do tecido é realizada.

Q-RT-PCR

A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (q-RT-PCR) pode medir os níveis de amplificação gênica ou o aumento dos níveis de expressão do mRNA em neoplasias. A técnica faz uso de um par de primers (iniciadores), uma sequência curta de nucleotídeos, que se ligam ao gene ou ao mRNA para amplificar um segmento alvo. Essa técnica pode ser realizada em tecido fresco congelado e em tecido fixado e incluído em parafina. O método tem boa sensibilidade, especificidade e analisa o status genotípico de forma quantitativa, o que possibilita a diminuição de variação interobservadora. Uma limitação da técnica pode ser a presença de muitos contaminantes na amostra investigada, pois durante o processo de extração do DNA ou RNA existe uma mistura de células neoplásicas, não neoplásicas ou de neoplasia não invasora. Para aumentar a chance de resultado favorável da reação, realizamos uma microdissecção da área de interesse na amostra parafinada.

Sequenciamento

A técnica de sequenciamento de DNA ou RNA é usada para determinar a ordem exata de nucleotídeos de um gene ou lócus alvo no genoma. A determinação de sequências de ácidos nucléicos tornou-se indispensável para a pesquisa biológica básica e diagnóstico médico, e em outras áreas, como biotecnologia, biologia forense, virologia e microbiologia. A velocidade rápida de sequenciamento atingido com a moderna tecnologia de sequenciamento de última geração tem sido fundamental e permite o sequenciamento completo de um genoma.

Sanger

O método de Sanger de sequenciamento de DNA é baseado na incorporação seletiva de dideoxinucleotídeos de terminação de cadeia pela enzima DNA polimerase durante uma replicação de DNA in vitro. O método Sanger é usado para validação dos resultados de sequenciamento de última geração e para a leitura de sequências de DNA ou RNA longas de 400 a 900 pares de bases. O método atinge 99,9% de acurácia.

Pirosequenciamento

O pirosequenciamento é um método de sequenciamento de acido nucleico (DNA/RNA) com base no princípio de sequenciamento por síntese. Esse método difere do sequenciamento Sanger, na medida em que se baseia na detecção da liberação de pirofosfato do nucleosídeo no momento da incorporação do nucleotídeo, em vez da terminação da cadeia com dideoxinucleotídeos. Ideal para leituras de 500 a 700 pares de bases. O método atinge 99,9% de acurácia.

Última geração

O sequenciamento de última geração é utilizado para o sequenciamento do genoma, re-sequenciamento genômico, leitura do perfil transcriptômico (RNA-seq, WTSS), análise de interações DNA-proteínas (ChIP-seq), e a caracterização epigenômica. O sequenciamento de última geração permite paralelizar o processo de sequenciamento, produzindo milhões de sequências simultaneamente (alto rendimento). As plataformas fazem leituras entre 35 a 400 pares de bases. O método atinge 99,9% de acurácia.

Lista de Mutações

• ALK
• BRAF
• EGFR
• HRAS
• KRAS
• NRAS
• ETV6/NTRK3 (fibrossarcoma infantil)
• EWSR1/ATF1 (sarcoma de células claras de tecidos moles)
• EWSR1/DDIT3 (lipossarcoma mixóide)
• EWSR1/ERG (sarcoma de Ewing)
• EWSR1/ETV1 (sarcoma de Ewing)
• EWSR1/FEV (sarcoma de Ewing)
• EWSR1/FLI1 (sarcoma de Ewing)
• EWSR1/WT1 (tumor de células redondas pequenas desmoplásico)
• FOXL2
• FUS/CREB3L1 (sarcoma fibromixóide de baixo grau)
• FUS/CREB3L2 (sarcoma fibromixóide de baixo grau)
• FUS/ERG (sarcoma de Ewing)
• FUS/DDIT3 (lipossarcoma mixóide)
• IDH1
• Instabilidade de Microssatélites (MSI)
• KIT
• MGMT
• MLH1 (metilação)
• NR4A3/EWSR1 (condrossarcoma mixóide extraesquelético)
• NR4A3/TAF15
• PAX3/FOXO1 (rabdomiossarcoma alveolar)
• PAX7/FOXO1 (rabdomiossarcoma alveolar)
• PDGFRA
• SS18/SSX1 (sarcoma sinovial)
• SS18/SSX2 (sarcoma sinovial)
• SS18/SSX4 (sarcoma sinovial)